Красимира Захариева: Отговорът на CRISPR на антибиотичната резистентност
Научна информация
Бързата поява на резистентни към антибиотици бактерии и сравнително ограниченото развитие на нови антибактериални молекули представляват сериозна заплаха за съвременната медицина, като е застрашена способността да се лекуват и предотвратят инфекции. Прекомерната употреба на антибиотици както при животните, така и при хората улесни появата на мултирезистентни (MDR) бактерии. Освен това много антибиотици нямат специфичност, безразборно убиват патогенни и непатогенни бактерии и допринасят за трудното лечение на обикновени инфекции. Това подчертава критичната необходимост от нови терапевтични средства, които заобикалят съществуващите механизми на лекарствена резистентност, като същевременно добавят по-висока специфичност. За постигането на тази цел се проучват CRISPR/Cas системите (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat, което означава – групирани, равномерно разпределени, кратки палиндромни повторения, свързани с CRISPR протеинови системи) като възможни нови антимикробни средства с механизъм за насочване на антибиотиците по последователността на бактериални геноми и/или гени за резистентност. Тези обещаващи целеви терапии са във фокуса на синтетичните биологични компании като Locus Biosciences, Intellia Therapeutics и Eligo Bioscience. Въпреки че тези технологии са предимно в предклинична фаза, основната цел е да се осигури създаването на прецизни антимикробни средства за инфекциозните заболявания.
Много преди CRISPR да стане „суперзвезда“, която редактира генома, тя е изиграла важна роля в защитата на бактериите от атаката на бактериофагите. Сега изследователите го връщат – заедно с новия си набор от умения – обратно към бактериите, за да решат нарастващия проблем с антибиотичната резистентност и да предложат реалистични средства за отглеждането на микробиоми.
Изследователите пренасочват бактериални CRISPR системи, за да атакуват собствените хромозоми на гостоприемника.
През последните пет години системата CRISPR-Cas придоби сериозна слава, тъй като изследователите я превърнаха в мощен и прецизен инструмент за редактиране на генома. От въвеждането си от Jennifer Doudna и Emmanuelle Charpentier през 2012 г., редактирането на гени CRISPR възстанови надеждата за генна терапия, разшири способността да се създават животински модели на човешко заболяване, показа обещаващо лечение на вирусните инфекции и предостави опростени инструменти за редактиране на гени.
Невинаги е било ясно обаче, че CRISPR ще стане такава иновативна „суперзвезда“. Всъщност, тя води началото си като защитен механизъм при бактериите от нахлуващи фаги. „Спомням си, че за първи път научих за CRISPR преди седем години, когато малко беше известно за основните му механизми, да не говорим за биотехнологичния му потенциал. Беше поразителен начина, по който системата успя да направи разграничение между себе си и себе си и колко лесно би било системата да се насочи към бактериалния геном, сякаш е чужд генетичен материал“, е казал Chase Beisel от Държавния университет в Северна Каролина.
Изследователите, които са познавали CRISPR, преди да стане супер известен инструмент, изменят първоначалната му функция, като я използват, за да убиват бактериите, вместо да ги защитават. Подходът изглежда обещаващ инструмент в борбата срещу антибиотичната резистентност и предлага по-голяма прецизност от терапията с пробиотици за промяна на човешкия микробиом с цел подобряване на здравния статус.
Rodolphe Barrangou, също от Държавния университет в Северна Каролина, е работил с CRISPR повече от десетилетие и работата му е свързана с тестване на CRISPR за рязане на различни последователности, но когато са били насочени към бактериалната хромозома, повечето от клетките са умрели. "Смъртта е основният резултат; редактирането е страничен ефект, а не обратното – тъй като възстановяването на ДНК не е толкова напреднало при бактериите, както при еукариотите. След това осъзнахме, че можем да използваме самонасочването, за да убиваме, а не да редактираме бактерии." е публикувано в научните му трудове. Когато бактериофагът инвазира археите или бактериите, системата CRISPR съхранява части от фаговата ДНК като вид имунна памет. След това клетката може да транскрибира РНК от съхранената последователност, да я свърже с ензима Cas и да настрои дуото да наблюдава клетката за съвпадащи нашественици. Когато РНК открие съвпадение, Сas разрязва фаговото ДНК, предотвратявайки възпроизвеждането му.
Екипът на Barrangou работи върху тезата, че ако могат да доставят специфични РНК в бактериите, те биха могли да провокират гостоприемниковата CRISPR система да елиминира плазмидите, носещи гени за антибиотична резистентност, да предотврати разпространението им или дори да разреже собствената хромозома на клетката, избирателно елиминирайки някои бактерии от популацията. През 2014 г. екипът на Barrangou и Beisel предоставят доказателство за този принцип в списанието mBio, където те показват, че могат да предизвикат клетъчна смърт или с гостоприемникови CRISPR системи, или чрез импортиране на компонентите на CRISPR в клетките, и че клетъчната смърт настъпва независимо от това къде в генома са били насочени системите. Техният подход им дава възможност специално да елиминират определени бактерии от смесени култури и да управляват нивото на клетъчна смърт. С тези резултати екипът показва потенциала за разработване на този метод, основан на CRISPR, като нов клас антибиотици.
"Красотата на CRISPR досега е, че той може да атакува и убива резистентни към антибиотици бактерии толкова лесно, колкото чувствителните към антибиотици бактерии. Другата полза е, че CRISPR може да бъде насочен само към патогените, потенциално запазвайки местните бактерии и техните ползи за здравето", подчертава Beisel.
За да внедрят тази система CRISPR като антибиотик, изследователите са въвели няколко различни възможности за доставка, като бактериофагите показват най-обещаващ потенциал. Предизвикателството при бактериофагите обаче е, че те са много сложни „системи“, които не са основно проучени. В много отношения все още учените залагат на изучаване на бактериофагите и как могат те да бъдат модифицирани, за да опаковат надеждно целевия ДНК фрагмент, представляващ интерес и да го доставят на определена бактериална популация. Екипът на Beisel работи по модифициране на бактериофаговите въси, които разпознават и свързват прицелните бактерии, за да разширят обхвата на потенциалните бактериални цели за CRISPR антибиотиците.
Много литични бактериофаги имат вродени микробицидни и антивирусни свойства, които Dave Ousterout от университета Дюк планира да вземе предвид и да използва за създаването на антибиотици, базирани на CRISPR, за да повиши терапевтичната ефикасност. Докато литичните фаги могат да убиват клетките сами и да имат отлични профили за безопасност, те трябва да се размножават в рамките на клетката гостоприемник, за да упражняват своя ефект и да имат ограничен обхват на гостоприемника, който признак не е лесен за промяна. Зареждането им с CRISPR заобикаля необходимостта от репликация, за да убие клетката, и избягва регулаторни опасения, които произтичат от използването на размножаващ се и потенциално мутиращ фаг. „С CRISPR-въоръжени фаги, тези терапии могат да бъдат разработени и оптимизирани срещу по-традиционни фармакокинетични параметри, като персистиране, време и продължителност на инфекцията, концентрация на частици мястото на инфекцията“, е обяснил в научните си доклади Ousterout.
Докато CRISPR, пренасян във фаги, изглежда идеален за лечение на бактериални инфекции, всички антимикробни агенти оказват силен селективен натиск, повишавайки възможността бактериите да развият резистентност. Поради гъвкавостта на CRISPR системите, изследователите могат да продължат да изпреварват естествено възникващите промени в тези системи и бързо да преработят новите поколения антибиотици, базирани на CRISPR, за да надхитрят бактериалната еволюция.
„Ние сме силно уверени, че CRISPR-Cas3, поради способността си да се насочва едновременно към много сайтове в генома, може да избегне потенциални механизми за съпротива“ е доказал Ousterout. За убиване на клетки, Cas3 е по-добър вариант от Cas9, който обикновено се използва в задачи за редактиране на генома; CRISPR Cas9 създава двойни скъсвания, които клетките могат да поправят, докато разцепването на Cas3 в генома е необратимо. „Нашият подход за разработване на подходящи бактериофагови вектори зависи от използването на коктейл от фаги, които атакуват бактериите по различни начини. Взети заедно, тези подходи ще смекчат шансовете за бърза съпротива и придобиване на резистентност.“ е посочил екипът на Ousterout.
Въпреки че разработването на нов клас антибиотици е основен приоритет за човешкото и животинското здраве, тази технология може да се разпростре далеч отвъд терапията и лечението на бактериални инфекции. През последните години микробиомът стана почти толкова „интересен“, колкото самия CRISPR, и доказа, че влияе на човешкото здраве по изненадващи начини – от метаболизма, сърдечната функция и болката до невродегенерацията и психичното здраве. Много изследователи виждат потенциала на CRISPR за промяна на микробиома с цел подобряване на здравето и са готови да разработят начини за това. Фекалните трансплантации и пробиотици се оказаха полезни в ограничени случаи и лечението е с временен характер, тъй като селективният натиск вероятно ще върне бактериалната популация обратно към първоначалния си баланс. „Тази CRISPR технология има потенциала да даде възможност за високо селективно отстраняване на избрани видове в сложни полимикробни съобщества като човешкия или животинския микробиом“, върху което работи Ousterout и екипът му.
Това ниво на прецизност улеснява много по-задълбочените изследвания на микробните съобщества, тъй като отделните микробни членове могат да бъдат елиминирани селективно, за да се определи тяхната роля в общата бактериална популация. Тези системи също така предлагат реалистичен механизъм за микробно „земеделие“ – избирателно култивиране на здрави микробиоми.
Barrangou, Beisel, Ousterout и екипите им наскоро са основали Locus BioSciences (https://www.locus-bio.com/technology/) за разработване на антимикробни средства с тесен спектър за справяне с огнищата на резистентни към антибиотици бактериални инфекции. В момента компанията разработва бактериофаг доставяна CRISPR система за елиминиране на C. difficile, без да се увреждат други чревни микроорганизми. "Смятаме, че това ще позволи възстановяването на нормалния микробиом и ще осигури защита срещу персистиращи инфекции, причинени от C. Difficile. С това доказателство за ефикасност за ново антимикробно средство с тесен спектър Locus BioSciences ще премине към прилагане на тази технология към други бактерии в микробиома, които могат да причинят различни заболявания при хората и животните, като колит, диабет и потенциално дори неврологични разстройства.“ е казал Ousterout.
Barrangou и екип са представили на конференция за CRISPR през 2017 г. в Big Sky, Монтана, че новото CRISPR антимикробно лекарство действа и се толерира добре при смъртоносни инфекции и при определени животински модели. Повече информация за проучванията на Barrangou, Beisel и Ousterout може да бъде намерено на следните линкове:
Специфично за последователността насочване от CRISPR/Cas
В проучването си, Dennise Palacios Arayan, Kelli L. Palmern, Breck A. Duerkoр на тема „CRISPR-based antimicrobials to obstruct antibiotic-resistant and pathogenic bacteria“ доказват още веднъж, че CRISPR/Cas системите са адаптивни защитни механизми срещу мобилни генетични елементи (MGE). Основен отличителен белег на тези системи е масивът CRISPR, локус в генома, състоящ се от уникални спейсърни елементи, редувани от еднакви повторения. Ефекторните протеини функционират като интерференционни молекули за заглушаване на чужди генетични елементи. По време на адаптацията някои типове CRISPR интегрират кратък фрагмент от чужда ДНК в масива CRISPR, като по този начин осигуряват генетична памет за инвазия на MGE, наричана спейсър (Фиг. 1). Транскрипцията на CRISPR масива дава прекурсорни CRISPR РНК (pre-crRNAs), които са ензимно обработени в зрели crRNAs (Фиг. 1). При инвазия на бактерии от MGE с комплементарна последователност, crRNAs насочват ефекторните протеини към тези мишени за ензимно разцепване, като в крайна сметка причиняват специфично за последователността елиминиране на нахлуващата молекула (Фиг. 1).
Системите CRISPR/Cas са групирани в 2 класа и допълнително класифицирани в 6 подтипа (I-VI). Типове I, III и IV използват протеинови комплекси с няколко вида за интерференция, докато типове II, V и VI използват единичен ефекторен протеин.
Фиг. 1.1: Групи CRISPR/Cas системи и механизмът им на действие
